發生Bleedthrough和crosstalk的原因是在熒光顯微鏡中經常被混淆的兩(liang) 個(ge) 問題，當然這兩(liang) 種現象本身也不宜分清，本文對這兩(liang) 者進行解釋，方便對症下藥解決(jue) 問題。
Bleedthrough還是Crosstalk，這是一個(ge) 問題
以下三張放大40倍圖片是FITC標記的肌動蛋白和Cy3標記線粒體(ti) ，並使用Lumencor SPECTRA X八通道LED顯微鏡光源對兩(liang) 種熒光染料進行激發，用於(yu) 顯示Bleedthrough和crosstalk的不同表現以及不同的解決(jue) 方案。
圖1.SPECTRA X 光引擎
青色光通道激發，485/25濾光片，Semrock LED-DA/FI/ TR/Cy5-4X 四帶通多邊分束器和發射濾光片
在這幅圖像中同時存在bleedthrough和crosstalk現象。Bleedthrough表現為(wei) 圖像中細胞外灰度相對較高(對比圖2，已消除bleedthrough的情況)。
圖2.SPECTRA X 光引擎
青色光通道激發，475/28濾光片，Semrock LED-DA/FI/ TR/Cy5-4X 四帶通多邊分束器和發射濾光片
通過改變激發濾光片的通帶，使其不與(yu) 多邊發射濾光片的通帶相交，從(cong) 而消除了bleedthrough。Bleedthrough的原因是激發光通過發射濾光片傳(chuan) 輸到相機。通過檢測細胞核周圍的線粒體(ti) 熒光，本圖像中仍然存在crosstalk(與(yu) 圖3相比，圖3消除了crosstalk，產(chan) 生肌動蛋白的特異性圖像)。
圖3.SPECTRA X 光引擎
青色光通道激發，475/28濾光片，Semrock 單帶通FITC二向色鏡和發射濾光片
從(cong) 根本上說，crosstalk是由於(yu) 熒光團(如FITC和Cy3)的激發和發射光譜的波長範圍有所交集。即使Cy3熒光團是較合適被綠色(~550 nm)光激發，它同樣也能被青色(475 nm)光激發到足夠的程度，在圖2中很容易被檢測到。通過將四帶通多邊分束器和發射濾光片改為(wei) 單帶通二向色鏡和發射濾光片來消除crosstalk信號，從(cong) 而在檢測係統的發射側(ce) 實現了更精確的阻擋。這種解決(jue) 方案是一種妥協，因為(wei) 它以速度為(wei) 代價(jia) 提高了分辨率。
當然在熒光成像時，我們(men) 需要盡可能的去減小bleedthrough以及crosstalk的影響
選擇熒光染料時，應盡量選擇發射光譜帶寬較窄的
同時使用多種熒光染料時，應盡量選擇光譜間沒有重疊的，以免產(chan) 生信號串擾，或者也可適當降低某幾種熒光染料的濃度。如下圖中DyLight 405，FITC以及Texas Red三種熒光染料，發生光譜間幾乎沒有重疊，以他們(men) 進行三種顏色標記時發生的串色效應就會(hui) 很小。
熒光團激發和發射光譜必須與(yu) 係統的光源和濾光片組特性相匹配
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