樣品的無標簽評價(jia) 在製藥和醫療領域有著各種国产成人在线观看免费网站，3D細胞樣品的熒光染色經常由於(yu) 熒光探針無法滲透到組織中而失敗。但是可通過在狹縫掃描拉曼顯微鏡中使用貝塞爾束照明來實現對細胞球體(ti) 的無標記觀察和分析，其中貝塞爾束從(cong) 側(ce) 麵照射樣品，在分光光度計的入口狹縫共軛位置產(chan) 生拉曼散射，用於(yu) 高光譜拉曼檢測。
貝塞爾光束照明拉曼顯微
拉曼顯微鏡的光學係統可使用貝塞爾光束進行側(ce) 照明，如圖1所示。532 nm的激光器和軸錐棱鏡產(chan) 生貝塞爾光束，該光束通過NA為(wei) 0.6的水浸物鏡從(cong) 樣品側(ce) 麵引入。通過NA-0.8水浸物鏡在分光光度計入口狹縫上成像樣品沿貝塞爾光束產(chan) 生的拉曼散射，通過冷卻ccd相機獲得高光譜線圖像，實現高速拉曼成像，沿y軸平行檢測400個(ge) 拉曼光譜。物鏡的組合和選擇在一定程度上受到了物理上是否可能將它們(men) 放置在裝置中以及可以放置的被觀察樣本的大小的限製。另外一個(ge) 光路來誘導拉曼散射的外延線照明，使用一個(ge) 線形焦點，以能夠比較貝塞爾和傳(chuan) 統外延線照明模式之間的成像特性。使用圖1(a)中的倒立鏡可以切換兩(liang) 種成像模式。貝塞爾照明的偏振方向設置為(wei) x方向，使探測物鏡能夠有效地收集誘導拉曼散射。分光光度計的狹縫寬度設為(wei) 1 Airy單位，使狹縫共聚焦效應也可實現z向的空間分辨率。光學裝置的細節如圖1所示。
圖一
該顯微鏡的有效點擴散函數(PSF)是光學照明點擴散函數和檢測點擴散函數的乘積。如圖1(b)-(e)所示，與(yu) 外線照明相比，貝塞爾光束照明有效地降低了z方向PSF的延伸，表明貝塞爾照明可以提高軸向分辨率和背景消除。在貝塞爾束成像中，旁瓣可能是一個(ge) 問題，但在該照明模式中，入口狹縫減少了旁瓣對成像的影響，因此是實現各向同性空間分辨率的關(guan) 鍵因素。但是在貝塞爾照明時，較低的照度物鏡NA導致了較低的x方向空間分辨率。
在狹縫掃描拉曼顯微鏡中使用貝塞爾束照明來觀察厚的生物樣品，並證明了與(yu) 傳(chuan) 統外延線照明拉曼顯微鏡相比，在觀察球體(ti) 時，圖像對比度和實際分辨率的提高。貝塞爾照明和狹縫共聚焦檢測相結合的背景還原和各向同性空間分辨率大大提高了拉曼顯微鏡在厚細胞樣品觀測中的成像性能。
除了擴大拉曼顯微鏡觀察到的樣品範圍之外，考慮到拉曼散射是一種低效的物理相互作用，通常需要相對較高的激發光量，這種技術還有其他優(you) 勢。特別是在活體(ti) 生物標本中，非侵入性是至關(guan) 重要的，設計出減少光損傷(shang) 的方法是很重要的。在外延照明下，貝塞爾照明需要更少的照明功率來獲得相同數量的拉曼信號。這有利於(yu) 減少三維活細胞成像中的光損傷(shang) ，在某些方麵，類似於(yu) 光片熒光顯微鏡所取得的成果。
與(yu) 高斯光束相比，貝塞爾光束表現出較強的旁瓣，這使得貝塞爾光束用於(yu) 側(ce) 照時軸向分辨率降低。然而，結合狹縫掃描拉曼顯微鏡，狹縫檢測的共聚焦效應可以降低旁瓣對有效PSF的影響，如圖1(c)所示。除了旁瓣外，貝塞爾光束在光束傳(chuan) 播方向的光分布長度和均勻性方麵都比高斯光束有優(you) 勢。因此，狹縫共聚焦檢測可以成功地將高斯光束的上述優(you) 點引入到側(ce) 光顯微鏡中。
貝塞爾照明拉曼顯微鏡也有利於(yu) 提高低濃度樣品的靈敏度，因為(wei) 背景信號的存在在本質上限製了微弱信號的檢測能力。側(ce) 邊照明有效地降低了離焦平麵的背景信號，能檢測出背景貢獻較大時可能被鏡頭噪聲隱藏的微弱信號。由於(yu) 這種效應，靈敏度的提高足以擴大使用拉曼標簽和探針的小分子成像、超多重成像和代謝成像的国产成人在线观看免费网站範圍，這些領域的目標往往由於(yu) 靈敏度低而受到限製。作為(wei) 一種更通用的原理，低背景拉曼顯微鏡可以在較深的樣品中保持足夠的光譜和空間分辨率，可以擴大拉曼光譜在材料、生物、製藥和醫療等眾(zhong) 多研究和工業(ye) 領域的多功能性。
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