活生物體(ti) 的生物過程成像需要具有三維高時空分辨率的光學顯微成像手段。如，在體(ti) 腦成像需要亞(ya) 微米空間分辨率區分突觸(synapses)、神經元用來通訊和協調活動(communicate and coordinate activity)的特定亞(ya) 細胞結構等，以及亞(ya) 秒級時間分辨率來追蹤神經元活動。盡管在一個(ge) 體(ti) 積內(nei) (如跨同一神經元的樹突)研究突觸活動是常用的手段，但是仍然缺乏能以高時空分辨率對突觸進行三維成像的方法。
自適應光學+貝塞爾光束+雙光子熒光實現高時空分辨率在體(ti) 體(ti) 積成像
技術背景：
活生物體(ti) 的生物過程成像需要具有三維高時空分辨率率的光學顯微成像手段。如，在體(ti) 腦成像需要亞(ya) 微米空間分辨率區分突觸(synapses)、神經元用來通訊和協調活動(communicate and coordinate activity)的特定亞(ya) 細胞結構等，以及亞(ya) 秒級時間分辨率來追蹤神經元活動。盡管在一個(ge) 體(ti) 積內(nei) (如跨同一神經元的樹突)研究突觸活動是常用的手段，但是仍然缺乏能以高時空分辨率對突觸進行三維成像的方法。
在體(ti) 成像技術中，雙光子熒光顯微鏡(two-photon fluorescence microscopy, 2PFM)是對大腦這樣的不透明組織進行成像的z流行技術，其微小的雙光子吸收截麵將熒光產(chan) 生限製在顯微鏡物鏡的聚焦體(ti) 積內(nei) 。為(wei) 了對樣品中的單個(ge) 光學截麵進行成像，2PFM在二維掃描激發焦點並記錄每個(ge) 位置的熒光信號，衍射極限焦點提供z亮的熒光信號以及z高的空間分辨率。然而，隻有通過自適應光學(adaptive optics, AO)才能維持在體(ti) 深度的高空間分辨率，自適應光學可以測量和校正成像光穿過光異質樣品時在波前積累的光學像差。AO與(yu) 2PFM相結合，將校正的相位模式国产成人在线观看免费网站於(yu) 物鏡後瞳平麵(back pupil plane)的激發波前，可以實現衍射極限性能，並且可以在大腦表麵以下數百微米處解析突觸。
大腦的在體(ti) 成像也需要高時間分辨率，對於(yu) 大腦內(nei) 的功能成像，需要亞(ya) 秒級的時間分辨率來跟上神經元活動的產(chan) 生和傳(chuan) 播。傳(chuan) 統的2PFM通過在三個(ge) 維度上依序掃描其激發焦點來實現三維成像，這導致體(ti) 積成像速率遠低於(yu) 其二維幀率。使用貝塞爾光束作為(wei) 激發焦點的體(ti) 積2PFM成像，可以對焦點區域實現軸向拉長但是橫向受限，從(cong) 而能夠同時對由二維掃描區域和貝塞爾焦點的軸向長度定義(yi) 的體(ti) 積內(nei) 的結構進行成像，將二維幀速率轉換為(wei) 三維體(ti) 積速率。
然而，就像通過完全照射物鏡back pupil形成的傳(chuan) 統雙光子激發焦點一樣，通過用環形pattern照射pupil形成的貝塞爾焦點也會(hui) 經曆樣品引起的像差，在傳(chuan) 播通過像差媒介後降低光束輪廓。貝塞爾聚焦質量如何受光學像差影響，以及如何校正這些像差以在深度上恢複衍射極限性能仍然還知之甚少。
基於(yu) 此，美國加州大學伯克利分校的Wei Chen(一作)和Na ji(通訊)提出一種有效的自適應光學方法，可以校正物鏡焦平麵上貝塞爾焦點的失真波前，並恢複衍射極限成像性能，從(cong) 而實現在體(ti) 體(ti) 積成像的高時空分辨率。作者將AO Bessel聚焦掃描2PFM国产成人在线观看免费网站於(yu) 深度上達500um的斑馬魚幼苗和小鼠大腦體(ti) 積成像，證明了在體(ti) 突觸結構和功能測量的靈敏度和分辨率的顯著提升，從(cong) 而能以高精度對突觸鈣和穀氨酸活性進行體(ti) 積測量(包括同時記錄小鼠皮層中頂端和基底樹突棘的穀氨酸活性)。
(1)從(cong) 理論上和實驗上表征了不同像差模式如何影響2PFM中貝塞爾焦點的質量。
(2)通過在物鏡焦平麵而不是傳(chuan) 統AO中的光瞳(pupil)平麵控製激發波前，開發了一種高效且有效的像差校正方法，從(cong) 而能夠恢複衍射極限成像性能。
圖1、高效像差校正用於(yu) 貝塞爾焦點掃描2PFM
圖2、像差校正恢複衍射極限分辨率用於(yu) 斑馬魚幼苗在體(ti) 體(ti) 積成像
通過貝塞爾聚焦掃描在2 Hz的體(ti) 積速率下以及無AO和有AO的情況下對體(ti) 積(128×100×60 μm3，從(cong) Z=190µm到Z=250µm below pia)中GCaMP6s+樹突和樹突棘的自發鈣瞬變進行成像。
清醒小鼠在體(ti) 視覺皮層神經元基底樹突棘中視覺誘發穀氨酸信號(iGluSnFR-A184S)的體(ti) 積成像。通過貝塞爾聚焦掃描在無AO和有AO(128×128×60μm3，從(cong) Z=120μm到Z=180µm below pia)的情況對比。視覺刺激：偽(wei) 隨機序列中的12個(ge) 全場漂移光柵(0° 至330°，增量為(wei) 30°）。對每個(ge) 刺激重複20次試驗，視頻為(wei) 試驗平均結果。
附錄：
AO高斯和AO貝塞爾焦點掃描2PFM光路
(a)位於(yu) 激發激光器和2PFM之間的貝塞爾模塊照片。原始的高斯路徑(白虛線)和貝塞爾路徑可以通過翻轉反射鏡切換(b)貝塞爾模塊零件清單
參考文獻：Chen, W., Natan, R.G., Yang, Y. et al. In vivo volumetric imaging of calcium and glutamate activity at synapses with high spatiotemporal resolution. Nat Commun 12, 6630 (2021).
DOI：https://doi.org/10.1038/s41467-021-26965-7
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